彗星DNA电泳检测试剂盒

产品货号：

KL230329

中文名称：

彗星DNA电泳检测试剂盒

英文名称：

Comet DNA Electrophoresis Detection Kit

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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简要说明：

彗星DNA电泳又称单细胞凝胶电泳，是一种在单细胞水平上检测DNA损伤的经典技术。因其在荧光显微镜下，受损细胞的DNA像彗星的尾巴一样拖出，而得名。该方法的原理是：细胞经裂解去除细胞膜、脂质、蛋白质等后，DNA仍以“类核”形式附着在核骨架上。如果DNA有断裂，在电场作用下，断片会从类核中拖出，形成“彗星尾”。DNA损伤越严重，尾长越长，尾部荧光强度也越大。

产品特点：

即开即用，用户不用单独准备各成份。
经过精心优化，用户不需要单独摸索和优化各种条件。
适用于各种细胞。
可以检测各种DNA损伤，如如单链断裂、双链断裂、碱不稳定位点等。

产品组成：

组分	规格
琼脂糖凝胶A	5mL
琼脂糖凝胶B	5mL
彗星电泳专用裂解液	100mL
彗星电泳液	250mL
彗星电泳终止液	250mL
彗星DNA染色液	1mL

保存：室温，彗星DNA染色液需置于-20℃，有效期1年。

使用方法：
一、样品载玻片制备

第一层胶（底胶）：取已预涂正常熔点琼脂糖的载玻片，用75～80℃的琼脂糖凝胶A滴一滴约50μL在磨砂区，迅速盖上盖玻片，4℃固化5分钟。此层用于固定第二层胶。
第二层胶（细胞胶）：收集待测细胞，用PBS重悬，计数，调整浓度至约1E5个/mL。
将细胞悬液与37℃预热的琼脂糖凝胶B按1:3（v/v）比例迅速混匀。
取下第一层的盖玻片，立即将混合液滴加在第一层胶上，快速盖上新的盖玻片，避免产生气泡。
4℃避光固化10～15分钟，使琼脂糖完全凝固。

二、细胞裂解

水平推走盖玻片后将载玻片水平浸没于预冷的彗星电泳专用裂解液中。
4℃避光裂解过夜。

三、DNA解旋与电泳

解旋：从裂解液中取出载玻片，用PBS轻轻漂洗一次。然后水平放入电泳槽，加入新鲜预冷的彗星电泳液覆盖载玻片。在室温避光解旋20～30分钟。此步骤使DNA解链，暴露出断裂位点。
电泳：在相同缓冲液中进行电泳。条件通常为：低电压（~1 V/cm），高电流（~300 mA），4℃避光电泳20～30分钟。具体时间需根据实验室条件和损伤程度预实验优化。
电压/电流计算：“V/cm”指两个电极之间的电压除以槽内缓冲液的长度（cm）。关键：电泳必须在4℃冰水浴中进行，以防止过度电泳和缓冲液发热。

四、终止与染色

终止：电泳结束后，小心取出载玻片，水平置于终止液中5分钟。
脱水/干燥（可选）：可依次将载玻片浸入70%、95%、100%乙醇中各5分钟，然后室温干燥，便于长期保存。
染色：若已脱水干燥，需用PBS或去离子水复水5分钟。
每片载玻片滴加约50～100μL稀释好的荧光染料，盖上盖玻片。
避光染色15～20分钟，即可观察。

五、图像获取与分析

观察：在荧光显微镜下（选择SYBR Gold的蓝光激发/绿光发射），使用合适放大倍数（如200×或400×）观察。
拍照：随机选取至少50～100个细胞/组进行拍照。避免选择边缘、重叠或凋亡细胞（彗星尾极长，几乎无头）。
分析：使用彗星分析软件（如CASP，OpenComet等）进行分析，常用参数如下。
尾矩：尾长×尾部DNA百分比，是最常用的综合指标。
尾长：从彗星头中心到尾端的最长距离。
尾部DNA百分比：尾部的荧光强度占总荧光强度的百分比。
Olive尾矩：考虑了尾部分布，更稳定。

六、关键注意事项

全程避光、轻柔操作：从裂解开始，尤其是染色后，需严格避光以防DNA额外损伤和荧光淬灭。操作琼脂糖包被细胞时动作要轻柔。
对照设置：必须设立阴性对照（未处理细胞）和阳性对照（如用已知浓度的过氧化氢或辐射处理的细胞），以验证实验体系的有效性。
平行重复：每个实验条件至少需要独立的3个生物学重复，每个重复分析50～100个细胞。
无DNA酶操作：尽量使用无菌、无DNA酶污染的耗材和试剂。
参数优化：裂解时间、电泳电压/时间对结果影响巨大，需根据细胞类型和损伤类型进行预实验优化。

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